Tip:
Highlight text to annotate it
X
Welkom op de Novus visuele protocol serie
In dit filmpje leer je hoe je alle fasen van fluorescerende uit te voeren
immunocytochemie
met de gebruikelijke methoden voor deze test.
Voordat u begint met het ICC procedure, zullen we zien hoe voor te bereiden
coverslips en celcultuur platen gevolgd door het plateren van de cellen.
We beginnen met zuur behandelen van nieuwe dekglaasjes in een molaire van zoutzuur voor
24 uur.
Na een zorgvuldige decanteren uit het zuur en het verwijderen van het glas dekglaasjes,
wassen we elk met gedestilleerd water,
dan is een laatste spoeling met ethanol.
Als optionele stap kunt u plaatsen de dekglaasjes in een subbing rack
onderdompelen
een 0,1 mg / oplossing gelatine of polylysine
gedurende vijf minuten.
Deze coatings aide deze extra hechting van cellen aan de
dekglaasjes
zodat ze niet los in latere wasstappen.
Na de behandeling verwijdert u de substraatlaag rack en droog de dekglaasjes in de cultuur
kap of een hete oven.
Droge coverslips worden vervolgens in elk putje van zes goed
cultuur plaat
en bedekt met een deksel.
Om tijd te besparen, kunnen grote hoeveelheden platen van tevoren worden voorbereid voor later gebruik.
De platen kunnen ook worden gesteriliseerd door ze onder UV-de motorkap is licht.
Met schone dekglaasjes bereid in zes well platen,
kunnen we nu onze cellen.
Gevlochten hier in cellen voeg een dichtheid van een half miljoen cellen per well.
Cellen worden vervolgens gedurende de nacht gekweekt in de couveuse of tot het bereiken van de gewenste
dichtheid.
Met de cellen uitgeplaat op de vorige dag en overnacht gekweekt, zijn we klaar
beginnen met het ICC procedure.
Op deze eerste dag van de ICC, zullen we fix,
permeabiliseren,
blot en voeg een primair antilichaam aan de cellen.
Beginnen opzuigen kweekmedium uit elk putje gevolgd door fixatie van de
cellen met 4% formaldehyde of 10% formaline
gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
Aspireren fixatief en spoel elk putje tweemaal met ijskoud PBS.
Wees voorzichtig niet te laten de cellen uitdrogen in deze
of een verdere stap van het protocol.
Als het epitoop van eiwit van belang wordt intracellulair tot expressie,
cellulaire permeabilisatie noodzakelijk voor het antilichaam om toegang tot de
cel.
Hoewel er veel verschillende
permeabilisatie agenten, de meest voorkomende zijn 0,1 tot 0.5%
concentratie
Tween-20
of Triton-X100
verdund in PBS.
Tween-20 wordt gebruikt voor epitopen in cytoplasma
terwijl Triton-X100 wordt gebruikt voor permeabilizing de kern en mitochondria.
Incuberen met putjes permeabilisatie buffer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
Aspireren permeabilisatie buffer en was driemaal gedurende 5 minuten elk met
PBS touw.
PBS touw bevat 0,1% Tween-20.
We zullen nu voorkomen onspecifieke bindingsplaatsen met blokkeerbuffer gedurende 1 uur
bij kamertemperatuur.
De beste blokkerende buffer PBST dat 10% serum van de gastheer
soorten van uw secundaire antilichaam.
Echter
1% BSA in PBST kunnen ook worden gebruikt.
Het primaire antilichaam te bereiden door het te verdunnen in blockingbuffer
bij de aanbevolen verdunning die door de datasheet.
Meerdere strakker verdunningen zijn gunstig om rekening te houden voor variabelen die kunnen worden
in verschillende assay
en voor het bereiken van de beste resultaten.
Incubeer bij 4 graden Celsius gedurende de nacht.
In ons voorbeeld,
Aangezien we gebruik maken van een niet-geconjugeerd primaire zullen we met behulp van een fluorofoor
geconjugeerd secundair op dag twee.
In de tijd van twee van onze ICC procedure
voegen we onze secundair antilichaam,
het uitvoeren van een optionele dubbele etikettering en nucleaire etikettering stap,
monteren onze dekglaasjes om dia's,
en het verkrijgen van beelden van onze antilichamen met een fluorescentiemicroscoop.
Eerst hebben we aspireren uit primaire antilichamen oplossing gevolgd door het wassen van de cel
driemaal met PBST gedurende vijf minuten.
Vervolgens bereiden floraform geconjugeerd secundair antilichaam die binden aan de primaire
antilichaam.
Verdun de secundaire blockingbuffer
met de aanbevolen verdunning vermeld op de datasheet
en geïncubeerd kamertemperatuur gedurende een uur.
Dekking van de platen met folie voorkomt sensitieve kleurstoffen uit vernederend.
Zuigen uit het secundaire antilichaam oplossing gevolgd door wassen van de cellen
driemaal met PBST
vijf minuten.
Als een optionele stap een tweede primaire en secundaire paar kan worden gebruikt
een tweede epitoop visualiseren
door een andere verdieping voor.
Bovendien DNA bindende kleurstoffen zoals DAPI
kunnen worden toegepast zonder secundaire antilichamen.
Raadpleeg de volledige schriftelijke Novus Protocol voor nadere instructies voor het verdubbelen en
triple label.
Dekglaasjes zijn nu klaar om te worden gemonteerd op objectglaasjes.
Neem een schoon objectglas en breng een druppel antifade montage medium door langzaam
kiezen langs de zuiger van de pipet.
Verwijder voorzichtig een dekglaasje uit de put,
laat dan wassen te laten afdruipen
en plaats de cellen naar beneden op de dia.
Heldere nagellak kan worden gebruikt om het dekglaasje dichten en te voorkomen dat
uitdrogen.
Dia's kunnen nu worden gevisualiseerd onder een microscoop
of bewaard bij -20 of 4 graden Celsius
in een donkere glijbaan doos of dia boek.
Het beperken van de hoeveelheid tijd die elke dia wordt blootgesteld aan licht van de microscoop zal aide in
het verlengen van de fluorescerende signaal
en voorkomt foto bleken.