Tip:
Highlight text to annotate it
X
Welkom op de Novus Visual Protocol Series.
In deze video leert u hoe u alle fasen van een Western blot te maken met de uitvoering
meest gebruikte methoden voor deze test.
Voordat we kunnen beginnen met de blot te bereiden, moeten we eerst voor te bereiden onze steekproef lysaat.
In dit voorbeeld een eiwit lysaat van gekweekte cellen.
Hier de cellen tweemaal gewassen met ijskoude PBS en lysisbuffer genoeg
de cellen te dekken.
De keuze van lysis buffer sterk afhankelijk van de lokalisatie
Het eiwit van belang.
We schrapen de cellen en breng de cel oplossing in een centrifugebuis
op ijs geplaatst.
Om oplosbaar membraan-gebonden eiwitten te maken, moeten we sterker
Extractie reiniger voor geïsoleerde cytoplasmatische eiwitten vergeleken.
In dit voorbeeld zijn we een standaard RIPA buffer gebruikt, is de buffer overflow is een veel voorkomende
voor het verkrijgen van maximale opbrengst van eiwit. Tijdens de extractie van eiwitten van alle
cellulaire lokalisatie,
Het is zeer belangrijk om proteaseremmers zijn in lysis buffer Wat
een verergering van uw monster. Zo vers protease
Remmers houden monsters op ijs en werken snel.
We luizen de cellen door pipetteren en
gevolgd door incubatie op ijs gedurende dertig minuten.
Vervolgens werden de cellen gecentrifugeerd om een pellet.
Gooi de pellet en het supernatant. Dit is uw lysaat.
Bepaal de totale eiwitconcentratie van uw monster lysaat
Testen van een klein gedeelte van het lysaat met een algemeen verkrijgbare eiwit
Kwantificering als BCA assay.
Dit zal bij het laden dezelfde hoeveelheden eiwitten de gel ondersteunen.
Western blots worden traditioneel gereduceerd onder voorgevormde en gedenatureerd
Voorwaarden.
Deze voorwaarden kunnen eiwitten worden gescheiden door hun molecuulgewicht
in plaats van hun natieve conformatie of vorm lading.
Verminderen en monsters denatureren
Vul telkens in een laadbuffer traditionele Laemmli buffer.
Deze buffer bevat beta-mercaptoethanol of DTT om disulfide verminderen
Ridges tussen cysteines
Ter ondersteuning van SDS denatureren een negatieve netto eiwit
Glycerine, waardoor de druppel aan elk putje
Broomfenol visualiseren het lysaat
en een iconische buffer.
Celsius Votex elk monster en incubatie bij 95 graden gedurende vijf minuten
Denaturatie van eiwitten volledig. U bent nu klaar om uw monsters in een winkel
SDS-PAGE gel.