Tip:
Highlight text to annotate it
X
Na Electroforetisch van onze eiwitten aan een membraan zullen we nu blokkeren
vlek,
toepassing een primair antilichaam specifiek voor het proteïne van belang en een secundair antilichaam
die herkent het primaire antilichaam.
Verwijder eerst het membraan uit de cassette en spoelen driemaal
water.
Als optionele stap, kunnen we controleren de eiwitten werden succesvol overgebracht
door kleuring van het membraan met Ponceau rood.
Incubeer het membraan in ponceau vijf minuten en was met water tot
de banden zijn duidelijk.
Na verificatie van de blot kan dan de-gekleurd te zijn door te blijven wassen met
water of TBS touw totdat de kleurstof wordt volledig verwijderd.
We moeten alle delen van de blot die nog geen bevatten eiwitten te blokkeren.
Dit voorkomt niet-specifieke binding van het antilichaam en de totale
achtergrondsignaal.
Gemeenschappelijke blokkerende buffers bevatten 5% niet-vette droge melk voor de assay
in een TBS touw oplossing.
Maar gebruik geen melk bij het sonderen met fosfo specifieke antilichamen als het kan
veroorzaken een hoge achtergrond van de endogene fosfoproteïne, cesium.
Incubeer het membraan met blokkerende oplossing gedurende een uur bij kamertemperatuur geroerd
onder lichte agitatie.
Schenk de blokkerende oplossing en wassen met TBS touw gedurende vijf minuten.
We zijn nu klaar om onze antilichaam toe te voegen. Verdun het primaire antilichaam in een
blokkeerbuffer bij de concentratie aanbevolen op de datasheet.
Incubeer overnacht bij 4 graden Celsius onder voorzichtig schudden.
Een aanbevolen optionele stap is om ook gebruik maken van een positieve controle belaste antilichaam
waarmee de gebruiker om gelijke hoeveelheden totaal eiwit werden geladen in elke
goed en helpt bij het oplossen van problemen door het verwijderen van eventuele onzekerheden
de Western Blot procedure. De volgende dag afgeschonken het primaire antilichaam en
Was de membraan met grote hoeveelheden TBS touw en krachtig roeren
vijfmaal vijf minuten.
Deze strenge wast zijn van groot belang voor het verwijderen van niet-specifieke
achtergrondsignalen.
Na wassen verdunnen het secundaire antilichaam in blokkeeroplossing en
Incubeer het membraan gedurende een uur bij kamertemperatuur bij een concentratie
aanbevolen op de datasheet.
In ons voorbeeld de secundaire ook geconjugeerd aan HRP voor later
detectie.
Giet membraan en wassen secundaire met grote hoeveelheden TBS touw met
heftig roeren vijfmaal vijf minuten. U bent nu klaar voor de
detectiefase.