Tip:
Highlight text to annotate it
X
Met de cellen uitgeplaat op de vorige dag en overnacht gekweekt, zijn we klaar
beginnen met het ICC procedure.
Op deze eerste dag van de ICC, zullen we fix,
permeabiliseren,
blot en voeg een primair antilichaam aan de cellen.
Beginnen opzuigen kweekmedium uit elk putje gevolgd door fixatie van de
cellen met 4% formaldehyde of 10% formaline
gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
Aspireren fixatief en spoel elk putje tweemaal met ijskoud PBS.
Wees voorzichtig niet te laten de cellen uitdrogen in deze
of een verdere stap van het protocol.
Als het epitoop van eiwit van belang wordt intracellulair tot expressie,
cellulaire permeabilisatie noodzakelijk voor het antilichaam om toegang tot de
cel.
Hoewel er veel verschillende permeabilisatie middelen, de meest voorkomende
zijn 0,1 tot 0.5% concentratie van Tween-20 of
Triton-X100
verdund in PBS.
Tween-20 wordt gebruikt voor epitopen in cytoplasma
terwijl Triton-X100 wordt gebruikt voor permeabilizing de kern en mitochondria.
Incuberen met putjes permeabilisatie buffer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
Zuig permeabilisatie buffer en was driemaal gedurende 5 minuten
elk met PBS touw.
PBS touw bevat 0,1% Tween-20.
We zullen nu voorkomen onspecifieke bindingsplaatsen met blokkeerbuffer gedurende 1 uur
bij kamertemperatuur.
De beste blokkerende buffer PBST dat 10% serum van de
gastheersoorten van uw secundaire antilichaam.
Kan echter 1% BSA in PBST worden gebruikt.
Het primaire antilichaam te bereiden door het te verdunnen in blokkeerbuffer de aanbevolen
verdunning vermeld op de datasheet.
Meerdere strakker verdunningen zijn gunstig om rekening te houden voor variabelen die
kan verschillen in assay en
voor het bereiken van de beste resultaten.
Incubeer bij 4 graden Celsius gedurende de nacht.
In ons voorbeeld, want we zijn met behulp van een niet-geconjugeerd primaire zullen we met behulp van een fluorofoor
geconjugeerd secundair op dag twee.