Tip:
Highlight text to annotate it
X
Welkom op de Novus Visual Protocol Series.
In deze video leert u hoe u alle fasen van een Western Blot met behulp van de uit te voeren
meest gebruikte methoden voor deze test.
Voordat we kunnen beginnen met de voorbereiding van de vlek moeten we eerst voor te bereiden onze steekproef lysaat.
In dit voorbeeld zullen we bereiden een eiwit lysaat van gekweekte cellen.
Hier
we Spoel de cellen tweemaal met ijskoud PBS
en genoeg lysis buffer om de cellen te dekken.
De keuze van lysis buffer vooral afhankelijk van uw
keuze van eiwit van belang.
We schrapen de cellen en breng de cel oplossing op een centrifugebuis
op ijs geplaatst.
Met het oog op membraan gebonden eiwitten oplosbaar, zullen wij eisen dat sterker
extractie detergentia vergeleken met cytoplasmatische eiwitten geïsoleerd.
In dit voorbeeld
maken we gebruik van een standaard RIPA buffer,
die een gemeenschappelijke buffer voor verkrijgen van maximale eiwitopbrengst. Bij het uitpakken van
eiwitten uit alle cellulaire lokalisaties,
Het is zeer belangrijk om proteaseremmers in lysisbuffer die zal
voorkomen degradatie van uw monster. Gebruik altijd vers bereid protease
remmers, blijf monsters op ijs en werken snel.
We luizen de cellen door en neer te pipetteren
gevolgd door incubatie op ijs gedurende 30 minuten.
Centrifugeer de cellen tot een pellet.
Gooi de pellet en verzamel de supernatant. Dit is uw lysaat.
Bepaal de totale concentratie van uw proteïne lysaat door
het testen van een klein deel van uw lysaat
met een in de handel verkrijgbare eiwit kwantificatie assay
zoals de BCA.
Dit zal u helpen bij het laden van gelijke hoeveelheden van eiwit in uw gel.
Western Blots worden meestal voorgevormd onder gereduceerde en gedenatureerde
voorwaarden. In deze omstandigheden kunnen eiwitten worden gescheiden door hun
molecuulgewicht
in plaats van hun oorspronkelijke conformatie vorm of lading.
Te verminderen en te denatureren monsters,
vul telkens in een laad buffer zoals de traditionele Laemmli buffer.
Deze buffer bevat beta-mercaptoethanol of DTT te reduceren disulfide ruggen
tussen cysteines,
SDS om te helpen denatureren een netto negatieve eiwit,
glycerol, zodat de monsters weg te zinken in elk putje,
broomfenolblauw aan het lysaat en een iconisch buffer visualiseren.
Votex elk monster bij 95 graden Celsius gedurende vijf minuten
volledig denatureren de eiwitten. U bent nu klaar om uw monsters te laden
in een SDS PAGE gel.
Voor deze volgende stap zullen we scheiden de afzonderlijke eiwitten in onze steekproef
lysaat
op basis van hun molecuulgewicht
met een positieve elektrode een negatief geladen eiwit trekken.
Om dit te doen
We laden onze eerder bereide eiwit monsters in een in de handel verkrijgbaar
polyacrylamide gel.
Gels zijn verkrijgbaar in vaste percentages of gradiënten van acrylamide.
Hoe hoger de acrylamide kleiner het percentage gel
percentage.
Daarom hoger percentage gels zijn beter voor een laag gewicht eiwitten, laag percentage
gels zijn beter voor grote gewicht eiwitten en gradiënt gels kunnen worden gebruikt voor
eiwitten van alle grootten
vanwege hun uiteenlopend in poriegrootte.
Bereid uw gel door deze in de elektroforese-inrichting en
vullen met het runnen van buffer die geschikt is voor uw gel chemie.
Spoel de putjes van de gel met stromend buffer en voeg buffer aan de
kamers.
Laad uw monsters in de putjes.
Als u niet zeker bent van het bedrag te laden,
10 tot 30 microgram van totaal eiwit is een voorgestelde uitgangspunt
en de totale hoeveelheid monster geladen.
U zult ook moeten om goed te reserveren ten minste een voor voorgekleurde moleculair gewicht
ladder.
De ladder zal u toelaten om eiwitscheiding volgen tijdens
elektroforese en vervolgens eiwit gewicht te controleren in uw monster tijdens
latere analyse.
Sluit de elektroforese-eenheid en sluit deze aan op een voedingsbron. De meeste eenheden
loopt gewoonlijk 45-60 minuten op 200 volt
of totdat de laadbuffer bereikt de bodem van de gel.
Gedurende deze tijd negatief geladen eiwitten in elk monster zullen migreren naar
de positief geladen elektrode maken hun weg door het polyacrylamide
gel matrix.
In deze volgende stap, dan storten we ons scheiden eiwitten uit de gel
en in een vaste membraan of blot.
Dit is gebaseerd op hetzelfde principe als de vorige stap
waarbij een elektrisch veld wordt opgenomen in de negatieve eiwitten te verwijderen
naar een positieve elektrode.
Transfer kan onder natte of half-droge omstandigheden.
Hier zullen we tonen de traditionele natte overdrachtsmethode. Verwijder eerst
de gel uit de cassette
snijden het bovenste gedeelte met de putjes.
Notch de linker bovenhoek naar opgegeven gel oriëntatie.
Float de gel in overdrachtbuffer tijdens de voorbereiding van de overdracht sandwich.
Om de overdracht sandwich te maken
moet u een cassette,
spons, filtreerpapier
de gel
en uw keuze van een van beide PVDF of nitrocellulous membraan.
PVDF moet worden geactiveerd door onderdompeling van het membraan in ethanol
twee minuten. Maar ook andere dan deze van de PVDF of de keuze van nitrocellulous
membraan is een persoonlijke voorkeur.
Notch de linker bovenhoek om blot oriëntatie geven
en incubeer membranen in transfer buffer gedurende 10 minuten.
Een stapel door het plaatsen van de volgende componenten
van de zwarte negatieve kathode naar rode positieve anode:
spons,
filtreerpapier,
membraan,
(Pas op dat u de gel of membraan aanraakt met uw blote handen en het gebruik van
schone pincet of een spatel in plaats daarvan.
Het aanraken van het membraan tijdens geen enkele fase kan besmetten de blot en leiden tot
overmatige achtergrondsignaal. )
filtreerpapier
en spons.
Gebruik een schone roller met elke laag om zachtjes uit te rollen eventuele luchtbellen die kunnen worden
presenteren
omdat bellen zullen remmen efficiënte overdracht eiwit.
Vergrendel de cassette en plaats deze in het apparaat met koud
overdracht buffer
zorgen dat de cassette goed geplaatst is van negatief naar positief.
Om te voorkomen warmteontwikkeling, is het nuttig om te zetten met een koud
pak in de inrichting
inrichting of in een koude kamer met de spinner bar op de bodem van de kamer.
Sluit de tank af en sluit aan op een stroomvoorziening.
Voer de overdracht volgens de fabrikant die
normaal 100 volt dertig tot honderdtwintig minuten.
Na Electroforetisch van onze eiwitten aan een membraan zullen we
Nu blokkeren de vlek,
toepassing een primair antilichaam specifiek voor het proteïne van belang en een secundaire
antilichaam dat het primaire antilichaam herkent.
Verwijder eerst het membraan uit de cassette en driemaal spoelen in water.
Als optionele stap, kunnen we controleren de eiwitten werden succesvol overgebracht
door kleuring van het membraan met Ponceau rood.
Incubeer het membraan in ponceau vijf minuten en was met water tot
de banden zijn duidelijk.
Na verificatie
de blot kan dan worden gede-gekleurd door te blijven wassen met water
of TBS touw
totdat de kleurstof volledig verwijderd.
We moeten alle delen van de blot waarin geen eiwit te blokkeren.
Dit voorkomt niet-specifieke binding van het antilichaam en de totale
achtergrondsignaal.
Gemeenschappelijke blokkerende buffers bevatten 5% niet-vette droge melk voor de assay
in een TBS touw oplossing.
Maar gebruik geen melk bij het sonderen met fosfo-specifieke antilichamen
gebruikt kunnen hoge achtergrond van de endogene fosfoproteïne, cesium.
Incubeer het membraan met blokkerende oplossing gedurende een uur bij kamertemperatuur
temperatuur
onder lichte agitatie.
Schenk de blokkerende oplossing en wassen met TBS touw gedurende vijf minuten.
We zijn nu klaar om onze antilichaam toe te voegen. Verdun het primaire antilichaam in een
blokkeerbuffer bij de concentratie aanbevolen op de datasheet.
Incubeer overnacht bij 4 graden Celsius onder voorzichtig schudden.
Een aanbevolen optionele stap is om ook gebruik maken van een positieve controle antilichaam
waarmee de gebruiker om gelijke hoeveelheden totaal eiwit werden geladen
elk putje en assistenten in het oplossen van problemen door het verwijderen van alle
onzekerheden met de Western Blot procedure.
De volgende dag
decanteren uit het primaire antilichaam en was de membraan met grote volumes
van TBS touw en krachtig roeren
vijfmaal vijf minuten.
Deze strenge wast zijn van groot belang voor het verwijderen van niet-specifieke
achtergrondsignalen.
Na wassen verdunnen het secundaire antilichaam in blokkeeroplossing en incubeer
het membraan gedurende een uur bij kamertemperatuur bij een concentratie
aanbevolen op de datasheet.
In ons voorbeeld de secundaire ook geconjugeerd aan HRP voor later
detectie.
Giet membraan en wassen secundaire met grote hoeveelheden TBS touw met
heftig roeren vijfmaal vijf minuten.
U bent nu klaar voor de detectie fase.
In deze laatste fase zullen we aantonen signaal ontwikkeling met behulp van de meest voorkomende,
meest gevoelige en meest goedkope detectiemethode het elektrochemiluminescentiesignaal
(Of ECL) reactie.
Deze methode maakt gebruik van HRP enzym
dat was geconjugeerd aan de secundaire naar de ECL katalyseren en produceren
licht.
Een licht wordt dan verzameld op x-ray film en ontwikkeld
of gedigitaliseerd met behulp van een speciale camera gevoelig genoeg
voor deze toepassing.
We beginnen door gelijke delen ECL reagentia in een een-op-een verhouding
volgens de instructies van de fabrikant.
We zullen het membraan geïncubeerd gedurende 3-5 minuten zonder roeren.
Na incubatie decanteer ECL mengsel en gebruik maken van een laboratorium veeg te vegen overtollig
oplossing van de hoek van het membraan.
Plaats het membraan in een heldere plastic zoals een blad beschermer ter voorkoming
drogen. Voorkom dat het membraan volledig uitdrogen.
We kunnen nu gebruik maken van een roller te duwen uit alle bubbels of enige overtollige oplossing.
Onmiddellijk ontwikkelen van de membraan.
Zowel film en camera systemen kunt u handmatig de belichtingstijd
om een foto perfect Western Blot te garanderen.
Relatieve band dichtheden kunnen nu worden gekwantificeerd met in de handel verkrijgbare
software.
. Juiste molecuulgewicht kan ook worden gecontroleerd door het vergelijken van de band maten
molecuulgewicht ladder.